重癥新冠肺損傷的深度空間蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜

作為新冠病毒的主要靶器官，肺部在感染后會(huì)表現(xiàn)出異質(zhì)性的微環(huán)境，并且伴有各種組織病理學(xué)的變化。雖然目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種疫苗和靶向藥物，但是對(duì)于重癥的新冠患者，仍然沒(méi)有足夠的治療手段，主要原因?yàn)閷?duì)新冠感染相關(guān)的多器官損傷和衰竭機(jī)制了解不足。新冠大爆發(fā)后，有一系列研究利用scRNA-seq和DSP技術(shù)系統(tǒng)性描繪了新冠進(jìn)展過(guò)程中肺部各個(gè)區(qū)域的轉(zhuǎn)錄組圖譜，但是對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)，大都是基于塊狀組織樣品檢測(cè)（bulk tissue檢測(cè)）的結(jié)果，不可避免地?fù)p失了空間和細(xì)胞類(lèi)型信息。

近日，中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所石正麗教授課題組聯(lián)合南方科技大學(xué)田瑞軍教授課題組和華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院周亦武教授課題組，通過(guò)整合組織學(xué)檢查、激光顯微切割、超靈敏蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理（SISPROT）和DIA數(shù)據(jù)采集技術(shù)，在71個(gè)FFPE樣本中，共檢測(cè)超過(guò)一萬(wàn)種蛋白質(zhì)，系統(tǒng)性繪制了新冠患者肺部七個(gè)主要病理結(jié)構(gòu)的深度空間蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜。為理解新冠病毒引起的肺損傷機(jī)制提供了全新的空間維度視角，并為后續(xù)的藥物靶點(diǎn)篩選提供了堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。目前該項(xiàng)成果已經(jīng)以預(yù)印本的形式發(fā)布在bioRxiv上。

一、病理學(xué)指導(dǎo)的深度新冠肺損傷空間蛋白質(zhì)圖譜

為了系統(tǒng)表征新冠病毒感染對(duì)肺部各區(qū)域蛋白質(zhì)的影響，作者從武漢第一波大流行期間死于新冠感染的11名患者和3名意外死亡的健康人肺部收集了三種關(guān)鍵的肺結(jié)構(gòu)：肺泡上皮（AE）、支氣管上皮（BE）和血管（VE）。此外，作者還表征了新冠感染的其他四種標(biāo)志性肺部病理改變：細(xì)支氣管粘液栓（BMP）、肺部纖維化（PF）、肺泡炎癥（ASI）和增生性II型肺泡細(xì)胞（HAT2）。采用優(yōu)化的空間蛋白質(zhì)組學(xué)方案（優(yōu)化包括樣品前處理、激光顯微切割、色譜條件、質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集等方面），在以上兩類(lèi)人群10個(gè)區(qū)域的71個(gè)FFPE樣品中，總共定量蛋白質(zhì)超過(guò)1萬(wàn)種，平均每個(gè)區(qū)域定量超過(guò)8500種。進(jìn)一步對(duì)7個(gè)區(qū)域的特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行功能聚類(lèi)分析，作者確定了7個(gè)具有不同功能的蛋白質(zhì)cluster，表征新冠肺部不同區(qū)域。GOBP分析揭示了每個(gè)區(qū)域特有的生物學(xué)過(guò)程，例如cluster 1（BE）參與了纖毛組織和纖毛運(yùn)動(dòng)；cluster 3（AE）參與氣體運(yùn)輸和細(xì)胞群體增殖等。這些結(jié)果揭示了新冠肺炎肺區(qū)域之間不同的蛋白質(zhì)組特征和功能差異，較好地證明了空間蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集的可靠性。

圖1 高深度新冠肺損傷圖譜及功能聚類(lèi)分析

二、三種基本肺結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)和相關(guān)通路的失調(diào)

對(duì)比新冠和非新冠組之間三種基本肺部結(jié)構(gòu)（AE、BE和VE）的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，PCA分析顯示三個(gè)區(qū)域的新冠和非新冠樣品可以很好地區(qū)分開(kāi)，隨后篩選差異倍數(shù)>2，p<0.05的蛋白質(zhì)，在三個(gè)區(qū)域分別篩選到1486、832和912個(gè)顯著差異蛋白。

AE是肺內(nèi)負(fù)責(zé)氣體交換的薄壁結(jié)構(gòu)，肺損傷后，過(guò)渡態(tài)的肺泡上皮細(xì)胞（PATS）會(huì)顯著增加。組學(xué)結(jié)果表明，PATS的三種蛋白標(biāo)志物KRT8、CLDN4和IL1R1顯著上調(diào)，證實(shí)了其在新冠患者肺部的存在和擴(kuò)增。并且NKX2-1（一種肺腺癌致癌基因）的表達(dá)上調(diào)并通過(guò)IF驗(yàn)證，進(jìn)一步支持了前人報(bào)道的PATS細(xì)胞為癌細(xì)胞樣細(xì)胞的假設(shè)。在新冠患者肺部BE區(qū)域，觀察到與之前轉(zhuǎn)錄組報(bào)道一致的CXCL1、CCL19的上調(diào)，表明炎癥組織損傷加重、肺損傷和呼吸衰竭。在新冠患者肺部VE區(qū)域，觀察到SAA1和SAA2上調(diào)，這些蛋白也在重癥新冠患者血清中富集，顯示出其作為感染標(biāo)志物的潛力。此外，一些下調(diào)的蛋白，包括MUC16、PPBP、APOM、APOA1、APOC1和APOB等也與之前的血清轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果一致。

圖2 三種基本肺結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組結(jié)果

三、新冠肺損傷特殊病理變化的蛋白質(zhì)特征

作者對(duì)PF、BMP、ASI和HAT2四個(gè)病理性病變區(qū)域的蛋白質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步的GO和KEGG富集分析，結(jié)果表明，在PF區(qū)域，與過(guò)度膠原沉積和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生相關(guān)的一系列生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路顯著富集，如蛋白質(zhì)羥基化、膠原原纖維組織、膠原代謝過(guò)程、糖蛋白代謝過(guò)程等。BMP區(qū)域中，白細(xì)胞活化、防御反應(yīng)調(diào)控、免疫效應(yīng)過(guò)程、活性氧（ROS）正向調(diào)控等一系列免疫反應(yīng)相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程顯著富集，這也與之前研究發(fā)現(xiàn)的氣道粘液蛋白和浸潤(rùn)的先天免疫細(xì)胞是新冠感染患者肺中主要失調(diào)成分結(jié)果相符。ASI區(qū)域中富集的蛋白主要參與纖維蛋白溶解、急性期反應(yīng)、脂質(zhì)分解代謝過(guò)程和先天免疫反應(yīng)等。而對(duì)HAT2區(qū)域的GO和KEGG分析表明，最顯著富集的是表皮發(fā)育，這表明AT2細(xì)胞的功能障礙可能導(dǎo)致角質(zhì)化。上述結(jié)果揭示了新冠導(dǎo)致肺部損傷不同病理結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵通路和蛋白質(zhì)表達(dá)譜，作者隨后對(duì)其中部分代表性結(jié)果進(jìn)行了IF驗(yàn)證。

圖3 PF、BMP、ASI和HAT2區(qū)域蛋白質(zhì)的GO、KEGG功能富集分析

四、病毒入侵宿主和炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)失調(diào)

由于在新冠患者肺部的許多細(xì)胞類(lèi)型中都觀察到病毒感染和免疫反應(yīng)的激活，因此作者構(gòu)建了一個(gè)基于已報(bào)道和預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)集用于研究病毒入侵、宿主反應(yīng)和多個(gè)肺部區(qū)域炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)失調(diào)。結(jié)果表明，包括IFITM3、TMPRSS2、CTSB、FURIN等多種病毒感染相關(guān)蛋白上調(diào)。此外一些關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞因子，如SERPINE1、IL1RN、HGF等均顯著上調(diào)。為了驗(yàn)證組學(xué)結(jié)果，作者對(duì)新冠和非新冠肺組織進(jìn)行了IFITM3、FURIN、HGF和OSMR的免疫組化染色，結(jié)果與組學(xué)結(jié)果一致。

圖4 與病毒入侵、炎癥相關(guān)的蛋白質(zhì)失調(diào)

綜上所述，作者基于激光顯微切割、SISPROT微量蛋白質(zhì)組樣品前處理以及質(zhì)譜檢測(cè)優(yōu)化了高靈敏度空間蛋白質(zhì)組技術(shù)方案，并以組織學(xué)特征為導(dǎo)向，特征性地描繪了高深度的新冠肺損傷空間蛋白質(zhì)圖譜。該技術(shù)方案具有可拓展性和用戶(hù)友好性，可以采用納克級(jí)起始樣品進(jìn)行深度蛋白質(zhì)組學(xué)分析。基于該方案所得到的空間蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，觀察到一系列新冠肺損傷引起的蛋白質(zhì)和功能的失調(diào)，特別是與免疫反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路。為進(jìn)一步揭示新冠肺損傷機(jī)制提供了全新的空間視角，也為確定治療干預(yù)的潛在靶點(diǎn)提供了堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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深圳市貝普奧生物科技有限公司是一家于2022年1月在深圳成立的蛋白質(zhì)組學(xué)研發(fā)型高科技公司。作為蛋白質(zhì)組學(xué)上游市場(chǎng)解決方案提供商，公司致力于對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的研發(fā)成果進(jìn)行商業(yè)開(kāi)發(fā)及轉(zhuǎn)化。團(tuán)隊(duì)以受多項(xiàng)專(zhuān)利保護(hù)的蛋白質(zhì)組學(xué)前處理系列產(chǎn)品為切入點(diǎn)，通過(guò)臨床功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)為目標(biāo)市場(chǎng)提供全流程解決方案。

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