近年來(lái)，隨著一系列集成化的樣本前處理技術(shù)和肽段組分分級(jí)技術(shù)的問(wèn)世，蛋白質(zhì)組學(xué)的靈敏度和通量得到了顯著提升。南方科技大學(xué)田瑞軍課題組發(fā)表了題為《Integrated proteomics sample preparation and fractionation: Method development and applications》的綜述性文章，全面梳理和比較了各種集成化方案以及它們?cè)诓煌瑯颖绢?lèi)型中的應(yīng)用，為相關(guān)領(lǐng)域的研究者提供了寶貴的參考。

PART.1

集成化樣本前處理方案比較

樣本前處理是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的重要環(huán)節(jié)，主要包括蛋白質(zhì)提取、還原、烷基化、酶解和除鹽等步驟。傳統(tǒng)的溶液內(nèi)酶解方法存在耗時(shí)長(zhǎng)（通常需要過(guò)夜酶解）和樣本起始量多（通常>100mg）的問(wèn)題。因此，如何將蛋白質(zhì)組學(xué)樣本制備所需的不同步驟和試劑進(jìn)行整合成為了集成化流程的核心挑戰(zhàn)。目前，根據(jù)蛋白質(zhì)酶解機(jī)制，有三類(lèi)整合方案：1、溶液內(nèi)酶解（in-solution）；2、on-beads酶解；3、固定化酶反應(yīng)器（IMER）。

表1. 溶液內(nèi)酶解的代表性方法及特點(diǎn)

在近20年里，溶液內(nèi)酶解一直是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要方法。然而，這種方法通常需要100微克到1毫克樣本，并涉及到多步樣本轉(zhuǎn)移，這會(huì)導(dǎo)致大量樣本損失，從而限制了在微量樣本中進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)的能力。為了解決這個(gè)問(wèn)題，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出三種具有代表性的方案，可以對(duì)微量樣本進(jìn)行高效的前處理：最早的FASP方案、用于微量樣本的iST方案和基于納米孔的nanoPOTS。其中，盡管iST方案已經(jīng)有商品化版本，但仍存在無(wú)法兼容高濃度去污劑的問(wèn)題。并且，由于C18和蛋白質(zhì)存在不可逆吸附，在微量樣本檢測(cè)時(shí)有潛在的樣本損失風(fēng)險(xiǎn)。

圖1. iST方案流程示意圖

表2. on-beads酶解的代表性方法及特點(diǎn)

為了進(jìn)一步降低樣本量的需求和盡可能集成化還原、烷基化等前處理步驟，on-beads酶解方案因其可以集成大多數(shù)前處理步驟、顯著提高反應(yīng)效率和可重復(fù)性高等特點(diǎn)，被廣泛使用，其中代表性的方案有SISPROT、STrap和SP3等。其中SISPROT方案實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)組學(xué)樣本制備和高pH 反相分級(jí)的完全集成化，通過(guò)離子交換原理實(shí)現(xiàn)對(duì)微量樣本蛋白質(zhì)富集的同時(shí)，很大程度上避免了蛋白質(zhì)和C18的直接接觸，因此大大提高了酶解效率和分級(jí)效率，減少了樣本的損失。

圖2. SISPROT方案流程示意圖

此外，盡管固定化酶反應(yīng)器（IMER）方法可以實(shí)現(xiàn)分鐘級(jí)酶解微量樣本，但是該方案?jìng)€(gè)性化程度較高，難以形成商業(yè)化版本廣泛應(yīng)用到各類(lèi)蛋白質(zhì)組學(xué)場(chǎng)景中。因此目前還處于技術(shù)方案開(kāi)發(fā)或?qū)嶒?yàn)室階段。

PART.2

全集成化2D/3D-SISPROT方案

蛋白質(zhì)因其眾多的異構(gòu)體和翻譯后修飾，通常在生物體內(nèi)有巨大的豐度差異，為了盡可能全面的表征樣本內(nèi)全蛋白質(zhì)表達(dá)水平，十分有必要對(duì)酶解后的肽段進(jìn)行分級(jí)。根據(jù)技術(shù)原理，可分為反相色譜分級(jí)和離子交換色譜分級(jí)兩種。

表3. 不同色譜分級(jí)方案特點(diǎn)

為了進(jìn)一步提高色譜峰容量，通常會(huì)采取多維度肽段分離方案，即結(jié)合具有正交分離能力的不同分離色譜柱，實(shí)現(xiàn)對(duì)低微克級(jí)樣本起始量的高深度蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)?；赟ISPROT技術(shù)，可以集成樣本制備、離子交換色譜分級(jí)和高pH 反相色譜分級(jí)于一體，實(shí)現(xiàn)三維肽段分離。第一維：細(xì)胞裂解物在離子交換樹(shù)脂上進(jìn)行酶解和分級(jí)；第二維：在C18膜片上進(jìn)行高pH反相分級(jí)；第三維：低pH RP LC-MS分析。通過(guò)采用集成化的SISPROT技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)樣本前處理的完全集成化，并且由于全部流程是通過(guò)離心的方式驅(qū)動(dòng)，因此可以實(shí)現(xiàn)批量樣本的同時(shí)處理，為進(jìn)一步自動(dòng)化前處理方案提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。

圖3. 2D/3D-SISPROT工作流程

PART.3

集成化樣本前處理技術(shù)的多場(chǎng)景應(yīng)用

血液作為臨床最容易獲取的樣本類(lèi)型，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)全面、無(wú)偏表征血液內(nèi)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平為發(fā)現(xiàn)新型標(biāo)志物提供了可能。然而，血液中蛋白質(zhì)豐度的動(dòng)態(tài)范圍極大，使得低豐度蛋白檢測(cè)存在很大挑戰(zhàn)。此外，臨床患者的個(gè)體差異要求臨床蛋白質(zhì)組學(xué)課題需要更大的入組隊(duì)列。因此，迫切的需求集成化、自動(dòng)化的樣本前處理方案，來(lái)提高整體檢測(cè)通量和穩(wěn)定性。

圖4. 自動(dòng)化血液樣本蛋白質(zhì)組學(xué)前處理方案

基于組織的蛋白質(zhì)組學(xué)可以提供關(guān)于細(xì)胞狀態(tài)和組織微環(huán)境信息，集成化的前處理方案可以大大提高對(duì)組織異質(zhì)性的解析能力，并使高分辨率的空間蛋白質(zhì)組學(xué)成為了可能。通過(guò)將激光顯微切割、SISPROT前處理技術(shù)和質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)合，開(kāi)發(fā)的LCM-SISPROT方案既實(shí)現(xiàn)了H&E染料的有效去除，又實(shí)現(xiàn)了對(duì)微小切割區(qū)域的高深度蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)。并且，通過(guò)進(jìn)一步升級(jí)，作者實(shí)現(xiàn)了空間的N-糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)。

圖5. LCM-SISPROT流程示意圖

相較于體液和組織，細(xì)胞樣本可以更深入研究細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，特別是蛋白復(fù)合物和翻譯后修飾的表征。針對(duì)珍貴的原代細(xì)胞和罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型的高深度蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)已經(jīng)成為集成化前處理技術(shù)最成功的應(yīng)用領(lǐng)域之一。應(yīng)用案例：《蛋白質(zhì)互作研究方案新升級(jí)！應(yīng)用流程親測(cè)有效》。這些成功案例充分證明了集成化前處理技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的重要性和實(shí)用性。

本文詳細(xì)對(duì)比了目前的集成化方案，并介紹了這些集成化方案在不同場(chǎng)景的應(yīng)用。這些方案為生物學(xué)研究提供了重要的技術(shù)基礎(chǔ)，使得我們能夠深入研究組織異質(zhì)性、發(fā)現(xiàn)新型生物標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)。隨著生物學(xué)研究的不斷深入，集成化蛋白質(zhì)組學(xué)樣本前處理技術(shù)的持續(xù)發(fā)展對(duì)推動(dòng)研究進(jìn)展具有重要意義

關(guān)于貝普奧生物

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深圳市貝普奧生物科技有限公司是一家于2022年1月在深圳成立的蛋白質(zhì)組學(xué)研發(fā)型高科技公司。作為蛋白質(zhì)組學(xué)上游市場(chǎng)解決方案提供商，公司致力于對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的研發(fā)成果進(jìn)行商業(yè)開(kāi)發(fā)及轉(zhuǎn)化。團(tuán)隊(duì)以受多項(xiàng)專(zhuān)利保護(hù)的蛋白質(zhì)組學(xué)前處理系列產(chǎn)品為切入點(diǎn)，通過(guò)臨床功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)為目標(biāo)市場(chǎng)提供全流程解決方案。

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