全自動、集成化蛋白質(zhì)組樣本制備平臺在高通量藥靶篩選中的應(yīng)用
近日，南方科技大學(xué)田瑞軍課題組開發(fā)了一種全自動、集成化的蛋白質(zhì)組學(xué)樣本制備流程（automated and integrated proteomics sample preparation，autoSISPROT），該技術(shù)流程能夠?qū)崿F(xiàn)在2.5小時(shí)內(nèi)同時(shí)完成96個樣本的蛋白質(zhì)組樣品前處理，即全自動化的完成蛋白質(zhì)酶解、肽段脫鹽和TMT標(biāo)記等工作。此外，他們還將autoSISPROT與CETSA-MS結(jié)合，進(jìn)一步構(gòu)建了自動化、高通量的藥物靶標(biāo)識別方案。目前該項(xiàng)成果已經(jīng)以預(yù)印本的形式發(fā)表在bioRxiv上。
研究背景
基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為系統(tǒng)表征蛋白質(zhì)豐度、翻譯后修飾和蛋白質(zhì)互作等領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)。隨著生物醫(yī)學(xué)日益增長的大隊(duì)列蛋白質(zhì)組學(xué)分析需求，對采用單純傳統(tǒng)手動方法處理數(shù)百個樣本提出了極大挑戰(zhàn)，例如存在通量低、極大依賴多步手動操作、多批次處理造成的樣本間相關(guān)性較差等諸多問題。與此同時(shí)，細(xì)胞熱位移分析結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)（cellular thermal shift assay-coupled to mass spectrometry，CETSA-MS）是目前藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)最有力的工具之一，但仍存在藥靶鑒定的分析通量低等不足。因此，亟需發(fā)展一種全自動化、高通量的樣本制備方法以滿足大隊(duì)列蛋白質(zhì)組學(xué)分析及后續(xù)的藥物靶標(biāo)篩選工作。
研究內(nèi)容
全自動集成96通道蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備平臺（autoSISPROT）開發(fā)及性能評估
作者前期研究開發(fā)了一種蛋白組學(xué)樣品前處理技術(shù)simple and integrated spintip-based proteomics technology （SISPROT），該技術(shù)可以完全集成樣品上樣、蛋白質(zhì)還原、烷基化、酶解、TMT標(biāo)記（可選）和脫鹽步驟于一體。AssayMAP Bravo是一種具有96通道移液頭的自動化液體處理平臺，該平臺可以在2.5-20 μL/min的范圍內(nèi)精確控制上下吸打的液體流速。基于集成化的SISPROT技術(shù)以及自動化AssayMAP Bravo平臺，該研究設(shè)計(jì)了autoSISPROT流程，通過自動化程序控制SISPROT小柱上的每個步驟所需的流速和處理時(shí)間（圖1a），實(shí)現(xiàn)在2.5小時(shí)內(nèi)自動處理多達(dá)96個樣品，全程無需人工干預(yù)。
圖1 autoSISPROT工作流程
為表征autoSISPROT平臺的樣本制備性能，作者分別對比了autoSISPROT平臺和手動SISPROT的差異，以及autoSISPROT平臺同時(shí)處理96個樣品的批次內(nèi)和批次間的重現(xiàn)性。與手動SISPROT相比，三個技術(shù)重復(fù)的結(jié)果顯示， autoSISPROT平臺處理的樣本定量精密度優(yōu)于手動處理，表明自動化的autoSISPROT帶來的操作誤差更小，重復(fù)性更高。此外，兼容TMT標(biāo)記的autoSISPROT平臺同樣展示了高效的TMT標(biāo)記效率（圖2）。
圖2 autoSISPROT對比手工制備
為評估大樣本制備時(shí)的批次內(nèi)和批次間數(shù)據(jù)重現(xiàn)性，作者在三個不同時(shí)間處理了三批96通道的HEK 293細(xì)胞裂解液（蛋白起始量為10 μg），每批次隨機(jī)抽取了10個樣本進(jìn)行質(zhì)譜檢測（圖3）。三個批次所定量到的蛋白質(zhì)數(shù)目以及肽段0漏切比例（室溫酶解1小時(shí)）的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%。三個批次所定量到的蛋白質(zhì)定量中位CV值都小于13%，表明批次內(nèi)重現(xiàn)性高。皮爾森相關(guān)系數(shù)顯示，不同批次間樣品相關(guān)系數(shù)大于0.91，批次內(nèi)兩個樣本大于0.99。綜上表明，autoSISPROT在樣本制備中可保障批次內(nèi)和批次間數(shù)據(jù)高度重現(xiàn)性。
圖3 autoSISPROT平臺批次內(nèi)、批次間性能比較
使用autoSISPROT平臺進(jìn)行自動化藥物靶標(biāo)識別
研究者以甲氨蝶呤（methotrexate ，MTX）為模型藥物，通過典型的CETSA-MS實(shí)驗(yàn)設(shè)置獲得40個樣品，用來檢測autoSISPROT識別藥物靶點(diǎn)的可行性（圖4a）。通常進(jìn)行40個樣本的前處理獲得用于LC-MS分析的TMT標(biāo)記肽整個過程都依賴于手動操作，需耗費(fèi)超過一天的時(shí)間才能完成，而利用autoSISPROT平臺與CETSA-MS技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行同樣40個樣品的制備則將用時(shí)縮短至3.5小時(shí)。與此同時(shí)，鑒定結(jié)果呈現(xiàn)出良好的重復(fù)性（圖4b）和較高的TMT標(biāo)記效率（>94%），且能夠非常顯著的識別MTX的已知靶標(biāo)-二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）（圖4d-e）。以上結(jié)果表明autoSISPROT能夠有效、準(zhǔn)確地識別藥物靶點(diǎn)，為藥物靶標(biāo)識別提供了一個自動化的樣本制備平臺。
圖4 autoSISPROT用于藥靶識別
高通量藥物靶點(diǎn)識別的方法探究與優(yōu)化
經(jīng)典的CETSA-MS技術(shù)受限于TMT標(biāo)記試劑通道，難以突破真正意義上的高通量，很難滿足大規(guī)模藥靶篩選對高通量的需求。為了探究高通量藥靶識別的可行性，該研究對將TMT和DIA用于CETSA-MS的兩種分析方法（分別稱為tmtCETSA和diaCETSA）進(jìn)行了比較（圖5a）。具體的比較方案是以staurosporine（一種泛激酶抑制劑）為模型藥物處理K562細(xì)胞裂解物并在52°C下進(jìn)行熱處理，然后采用 diaCETSA和tmtCETSA方法分別平行處理可溶性裂解物。diaCETSA和tmtCETSA兩種方法在蛋白質(zhì)水平上均獲得較高的Pearson相關(guān)系數(shù)（> 0.98）和良好的定量精度（中位CV值< 10%）（圖5c-d），表明這兩種方法均具有良好的定量重復(fù)性。此外tmtCETSA和diaCETSA兩種方法分別鑒定出120個和106個staurosporine蛋白靶點(diǎn)，且均滿足顯著性標(biāo)準(zhǔn)。該研究還進(jìn)一步優(yōu)化了diaCETSA方法以提高蛋白質(zhì)組分析的深度，并將經(jīng)過探索優(yōu)化的最佳樣品制備方法和質(zhì)譜儀條件等應(yīng)用于后續(xù)的diaCETSA 分析。
圖5 高通量藥靶識別的方法探究
實(shí)現(xiàn)高通量藥物靶點(diǎn)識別的可行性案例
該研究進(jìn)一步結(jié)合autoSISPROT與diaCETSA的方法進(jìn)行高通量的藥物靶點(diǎn)和非靶點(diǎn)鑒定，與經(jīng)典的CETSA-MS 相比，該方法將分析通量提高了 10 倍以上。通過autoSISPROT自動化處理 87 個樣品，對20種激酶抑制劑（kinase inhibitors，KIs）進(jìn)行基于diaCETSA方法的靶標(biāo)鑒定，蛋白鑒定數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明整個樣品制備過程中都具有良好的處理精度，在20種KIs中成功鑒定了12種KIs的已知靶點(diǎn)（圖6）。此外本方法還實(shí)現(xiàn)了潛在脫靶靶點(diǎn)的高通量鑒定。綜合以上結(jié)果和分析表明，autoSISPROT和diaCETSA聯(lián)合能夠以全自動的方式鑒定藥物靶標(biāo)和非靶標(biāo)，實(shí)現(xiàn)高通量的藥物靶標(biāo)鑒定。
圖6 高通量藥靶識別案例
研究總結(jié)
這項(xiàng)研究開發(fā)了一個全自動、集成式的蛋白質(zhì)組學(xué)樣本制備工作流程（autoSISPROT），實(shí)現(xiàn)了2.5小時(shí)內(nèi)同時(shí)處理96個樣本。此外，通過將autoSISPROT與CETSA-MS結(jié)合，利用DIA數(shù)據(jù)采集策略，實(shí)現(xiàn)了高通量的藥物靶標(biāo)篩選鑒定?？傊?，該研究為高通量蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備和藥物靶標(biāo)鑒定開發(fā)了一套全自動和集成化的工作流程。
參考文獻(xiàn)：
1. Qiong Wu et al. Fully automated and integrated proteomics sample preparation platfROm fRO high-throughput drug target identification, biROxiv, 2023
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