前言
多發(fā)性骨髓瘤是一種漿細胞異常增生的惡性腫瘤，目前普遍認為其預(yù)后不良與T細胞功能障礙有關(guān)，不同的免疫功能由高度分化的免疫細胞類型決定。以往的研究關(guān)注隨著疾病進展的CD4+和CD8+T細胞的變化，但普遍采用流式細胞術(shù)或RNA檢測的方法，其是否能直接反應(yīng)疾病狀態(tài)或影響預(yù)后仍存在爭議。同時，由于患者外周血分選T細胞不同亞型所獲得的細胞量極少，急需一種針對納克級樣品的蛋白質(zhì)組檢測方案，從蛋白質(zhì)層面評估不同免疫細胞類型對多發(fā)性骨髓瘤的預(yù)后的影響。
2021年南方科技大學(xué)田瑞軍課題組基于前期開發(fā)納克級蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理技術(shù)——SISPROT，在單個多發(fā)性骨髓瘤患者的4mL外周血內(nèi)分離并解析了8種原代T細胞亞型的深度蛋白質(zhì)組特征，并進一步開發(fā)了機器學(xué)習(xí)模型用以對T細胞不同亞群做精細化分型。該項結(jié)果已發(fā)表在Analytica Chimica Acta雜志上。
一、基于細胞分選的納克級蛋白質(zhì)組學(xué)方法開發(fā)
T細胞是抗癌的基本效應(yīng)細胞，特別是對血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者，因此，闡明T細胞亞群之間的蛋白質(zhì)特征對于理解腫瘤微環(huán)境的免疫抑制有重要意義。然而，臨床患者獲得的血液樣品有限，并且質(zhì)譜常規(guī)參數(shù)不適用于納克級樣品檢測，因此作者對分選、樣品前處理及質(zhì)譜參數(shù)均進行了優(yōu)化：分選時，優(yōu)先分選CD8+T細胞，從CD8-T細胞中分選CD4+T細胞以減少CD8+T細胞損失；采用10 μL的SISPROT低蛋白吸附槍頭以減少蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合；降低最小AGC目標、提高MS2分辨率和降低top-N等方式提高蛋白檢出。優(yōu)化后，10 ng 293T細胞樣本檢測到的蛋白和特征肽段分別提高了5.1和7.8倍。
圖1. 8種T細胞亞群的蛋白質(zhì)組流程及優(yōu)化結(jié)果
二、CD3+、CD4+和CD8+T細胞蛋白質(zhì)組學(xué)特征
以293T細胞作為對照，分別在293T及CD3+、CD4+和CD8+T四種細胞類型樣品中分別鑒定到7792、7290、7092和7132個蛋白質(zhì)。盡管PCA分析中，CD4+和CD8+T細胞并不能很好的區(qū)分開，但是火山圖顯示兩者差異蛋白較多，并且特征蛋白也得到了富集，如標志物蛋白CD4和CD8，組內(nèi)平行性也一致。生物學(xué)過程的功能富集顯示，293T主要富集核酸代謝過程和RNA過程，而三種T細胞則主要富集免疫調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)功能。
圖2. CD3+、CD4+和CD8+T細胞蛋白質(zhì)組特征
三、8種T細胞亞群的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
作者進一步對單個多發(fā)性骨髓瘤患者外周血的8種T細胞亞群進行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，為了更好的理解不同T細胞亞群的功能，CD4+T細胞根據(jù)功能亞型分類，而CD8+T細胞由于缺乏足夠的功能研究，因此按細胞分化程度分類。流式分選后，由于不同T細胞亞型獲得的細胞數(shù)量差異較大，BCA測定蛋白含量最少的樣品僅為77 ng。歸一化后，在8個T細胞亞群中，平均鑒定到4000個蛋白質(zhì)，其中超過70%的FACS標記蛋白被檢測到，并且其表達水平與已知的細胞亞型特征一致。此外，作者發(fā)現(xiàn)CD4+和CD8+T細胞的13個差異蛋白里，只有兩個與公共數(shù)據(jù)集健康人的免疫細胞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)相符，說明多發(fā)性骨髓瘤患者的CD4+和CD8+T細胞的蛋白質(zhì)組構(gòu)成有很大差異。
圖3. 8種T細胞亞群蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果
四、機器學(xué)習(xí)精細化區(qū)分T細胞亞群
對多發(fā)性骨髓瘤患者來說，基于蛋白質(zhì)組學(xué)的CD4+和CD8+T細胞亞群此前未有報道，并且T細胞亞群之間盡管差異較小，但在蛋白質(zhì)表達上存在實質(zhì)性差異，因此作者開發(fā)機器學(xué)習(xí)模型進一步篩選8種T細胞亞群的特征差異蛋白。首先，通過隨機森林模型，依據(jù)T檢驗篩選的差異蛋白分選CD4+和CD8+兩類T細胞。然后，通過支持向量機（SVM）模型，依據(jù)方差分析篩選的差異蛋白對CD4+和CD8+T細胞的四個亞群進行分類。并且通過隨機森林模型對單一亞群vs其余亞群進行交叉驗證。CD8+T細胞的前15個差異蛋白高度富集細胞過程、生物粘附和免疫粘附，而CD4+T細胞的前15個差異蛋白則主要富集細胞成分組織和對刺激的反應(yīng)，再次證明了CD4+和CD8+T細胞之間的差異。
圖4. 機器學(xué)習(xí)用以精細化分選8種T細胞亞群
總結(jié)
綜上所述，作者基于流式細胞分選、納克級樣品前處理（SISPROT）、質(zhì)譜條件優(yōu)化和機器學(xué)習(xí)數(shù)據(jù)分析實現(xiàn)了對免疫細胞亞群檢測的細胞類型蛋白質(zhì)組學(xué)。證明了從單個臨床患者獲取的少量外周血樣品，也可以進行免疫細胞的分選和高深度蛋白質(zhì)組的檢測。這一實驗方案對進一步研究疾病中免疫功能的失調(diào)、細胞類群之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了切實可行的實驗設(shè)計參考，為發(fā)現(xiàn)新的亞型特異性標記物及藥物靶點提供了全新的研究視角。
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