蛋白質(zhì)是一切生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是機體細胞的重要組成成分，它通過與其他生物分子的互作來執(zhí)行其生物學(xué)功能?；谫|(zhì)譜檢測研究蛋白質(zhì)互作的技術(shù)包括親和純化質(zhì)譜（AP-MS）、化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜（XL-MS）、蛋白質(zhì)共分離/洗脫質(zhì)譜（CF-MS），以及結(jié)合熱臨近共聚集（TPCA）和細胞熱位移分析(CETSA)的熱蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)（TPP）。傳統(tǒng)的TPP和TPCA工作流程對樣品量要求較高，通常每個溫度點需要超過100μg的蛋白質(zhì)，這將極大地限制其在稀有細胞和珍貴臨床樣品中的應(yīng)用。
2023年9月，南方科技大學(xué)Chris Soon Heng Tan教授團隊在Analytical Chemistry發(fā)表題為“Scaled-Down Thermal Profiling and Coaggregation Analysis of the Proteome for Drug Target and Protein Interaction Analysis”的研究論文，通過結(jié)合SISPROT技術(shù)（基于spintip的集成化蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理技術(shù)）和基于SISPROT tip的TMT標記技術(shù)開發(fā)了名為STASIS的工作流程，將樣品需求量從100μg降低至1μg，成功地將TPCA的應(yīng)用范圍擴展到罕見的原代細胞和寶貴的臨床樣品中，以分析其中蛋白質(zhì)復(fù)合物。
一、STASIS方案建立：提升低微克級批量樣品的結(jié)果均一性
傳統(tǒng)的TPP和TPCA流程對樣品量要求較大，因此作者首先對傳統(tǒng)流程進行優(yōu)化，達到對微量樣品的檢測中獲得與傳統(tǒng)方案相似的靈敏度和精度，主要調(diào)整包括：使用SISPROT樣品前處理技術(shù)，樣品在同一個spintip中完成還原、烷基化、酶解、TMT標記和除鹽過程，減少了傳統(tǒng)方案在樣品轉(zhuǎn)移過程中可能導(dǎo)致的樣品損失。與溶液中所需的100μg蛋白質(zhì)相比，SISPROT所需的蛋白質(zhì)量大大減少，僅需0.1-10μg的蛋白質(zhì)。并且，作者通過調(diào)整SISPROT上的肽段pH，實現(xiàn)了在同一個spintip上進行TMT標記。與傳統(tǒng)的溶液標記方法相比，基于SISPROT標記不僅大大減少了TMT試劑的使用量，還實現(xiàn)了批量樣品的平行處理，提升了檢測樣品通量和結(jié)果均一性。進一步對比了不同分離策略，作者確定了C18-18/6F分離方法質(zhì)譜分析時間短、共分離干擾分布均勻、各組分間鑒定的多肽重疊最少，為最佳的分離方法，在后續(xù)實驗中使用。
二、STASIS方案驗證：1μg蛋白即可實現(xiàn)強穩(wěn)定性和高靈敏度
確定分離方案后，作者評估了在經(jīng)典TPP實驗設(shè)計下，使用不同初始蛋白量（10μg、5μg和1μg）測試STASIS的穩(wěn)定性和靈敏度。結(jié)果表明，10μg、5μg和1μg分別鑒定到4914、4428和4096個蛋白質(zhì)，整體靈敏度較高。接著作者對比了不同蛋白起始量的組內(nèi)Tm的重復(fù)性，雖然隨著起始量的降低，Tm的重復(fù)性會略有降低，但結(jié)果依舊令人滿意。而對不同起始量中Tm的比較，作者發(fā)現(xiàn)1μg樣品的Tm與5μg和10μg樣品的Tm相關(guān)性較弱，考慮主要是由于蛋白質(zhì)濃度較低時，蛋白質(zhì)共聚集或沉淀減弱，但隨后的實驗表明這并不妨礙使用1μg的蛋白起始量來進行蛋白質(zhì)互作分析。
三、STASIS方案應(yīng)用于低微克級樣品的蛋白質(zhì)互作分析
TPCA假設(shè)相互作用的蛋白質(zhì)在熱變形過程中共聚集，具有類似的熱熔曲線，因此通過量化相互作用蛋白之間熱熔曲線的相似性來評估蛋白質(zhì)之間的相互作用。本文中，作者對三組不同蛋白質(zhì)起始量得到的TPP數(shù)據(jù)分析其TPCA特征，發(fā)現(xiàn)與已報道的數(shù)據(jù)具有高度的相似性。另外，令作者驚喜的是，使用不同起始蛋白量獲得的TPCA特征對相互作用蛋白質(zhì)對的可預(yù)測性非常相似，對于10μg、5μg和1μg起始蛋白量，AUC分別是0.64、0.63和0.64，即使樣品起始量低至1μg，也不影響TPCA的整體特征。作者認為這是由于TPCA特征是基于三個生物學(xué)重復(fù)中獲得了10個溫度點的平均值，因此減輕了質(zhì)譜讀數(shù)的隨機波動，使得無論起始的蛋白量多少，蛋白質(zhì)復(fù)合物的熱熔曲線相似度都比較高，如下圖中MCM復(fù)合物所示，在10μg、5μg和1μg蛋白起始量下，得到相似的熱熔曲線。以上結(jié)果表明，STASIS流程適用于微量樣品，如罕見細胞的蛋白質(zhì)互作分析
四、STASIS方案實測：高效識別藥物靶點
最后，作者使用經(jīng)典TPP實驗設(shè)計，即10個溫度點驗證了STASIS流程識別甲氨蝶呤（MTX）和帕比司他（PAN）結(jié)合靶點的能力。結(jié)果顯示，經(jīng)過藥物處理的樣品中Tm顯著增加，證明了STASIS流程對于微量樣品的穩(wěn)定性和靈敏度。同時，與預(yù)期結(jié)果一致的是，不論是MTX的結(jié)合靶點DHFR，還是PAN的結(jié)合靶點HDAC1、HDAC2均被識別出來。證明STASIS流程可用于識別藥物結(jié)合蛋白質(zhì)靶點，具有較高的靈敏度和特異性。
綜上所述，作者通過SISPROT樣品前處理技術(shù)，開發(fā)了STASIS流程，使得用更少的蛋白質(zhì)起始量和TMT標記試劑量進行熱蛋白質(zhì)組學(xué)研究，最少僅需1μg/溫度點，并且成功地鑒定了MTX和PAN的內(nèi)源性靶點。極大地擴展了熱蛋白質(zhì)組學(xué)研究的應(yīng)用范圍，使得從罕見的原代細胞或珍貴的臨床樣品中直接進行蛋白質(zhì)互作研究成為了可能。
About BayOmics
深圳市貝普奧生物科技有限公司是一家于2022年1月在深圳成立的蛋白質(zhì)組學(xué)研發(fā)型高科技公司。作為蛋白質(zhì)組學(xué)上游市場解決方案提供商，公司致力于對蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的研發(fā)成果進行商業(yè)開發(fā)及轉(zhuǎn)化。團隊以受多項專利保護的蛋白質(zhì)組學(xué)前處理系列產(chǎn)品為切入點，通過臨床功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺為目標市場提供全流程解決方案。
公司核心成員在蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域獲得重大科研成果，超半數(shù)員工擁有博士、碩士學(xué)位及海外研究經(jīng)歷。充滿創(chuàng)造力的團隊立足于大灣區(qū)，服務(wù)全球，專注于降低蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)難度，提升其在創(chuàng)新標志物和創(chuàng)新藥物研發(fā)全鏈條中的應(yīng)用，以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為重大疾病提供精準診療策略。
公眾號
