蛋白質(zhì)復(fù)合物由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）組裝而成，受到各種機(jī)制的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，對(duì)PPI的研究可以揭示各種細(xì)胞過(guò)程的潛在機(jī)制，并揭示它們的失調(diào)如何導(dǎo)致疾病，從而為開(kāi)發(fā)新的治療方法、識(shí)別新的藥物靶點(diǎn)提供先驗(yàn)知識(shí)指導(dǎo)。2018年開(kāi)發(fā)的熱臨近共聚集（thermal proximity co-aggregation，TPCA）方法率先使用熱蛋白質(zhì)組學(xué)分析來(lái)研究PPIs的動(dòng)力學(xué)和在原位大規(guī)模表征蛋白質(zhì)復(fù)合物，目前已獲得廣泛應(yīng)用。然而，傳統(tǒng)的TPCA方法需要大量的樣品和較長(zhǎng)的計(jì)算時(shí)間，并且一組10標(biāo)TMT試劑僅能用于標(biāo)記一個(gè)條件下的TPCA實(shí)驗(yàn)，因此實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品必須在不同時(shí)間通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行分析，容易引入批次效應(yīng)。

因此，TPCA的發(fā)明者，南方科技大學(xué) Chris Soon Heng Tan教授團(tuán)隊(duì)優(yōu)化了TPCA方法，提出了一個(gè)簡(jiǎn)化版本Slim-TPCA，使用更少的溫度點(diǎn)將通量提高了3倍以上，通過(guò)算法優(yōu)化，更好地識(shí)別PPIs的動(dòng)態(tài)變化，提高統(tǒng)計(jì)功效，并且通過(guò)結(jié)合SISPROT樣品前處理技術(shù)顯著減少樣品使用量。該成果已于2023年11月發(fā)表于Nature communications。

一、Slim-TPCA溫度點(diǎn)的優(yōu)化

在傳統(tǒng)TPCA方法中，需要10個(gè)梯度溫度，需要多套TMT試劑來(lái)標(biāo)記和分析不同條件的樣品，容易引入批次效應(yīng)。因此作者首先評(píng)估了使用更少的溫度點(diǎn)來(lái)分析PPI，作者發(fā)現(xiàn)雖然較少溫度點(diǎn)的預(yù)測(cè)能力略有下降，但仍在可接受范圍內(nèi)。接著，作者評(píng)估了哪種相似性度量方法更適合在溫度點(diǎn)較少的情況下使用，在曼哈頓距離、切比雪夫距離、余弦距離、皮爾森相關(guān)系數(shù)、PISA和ΔTm中，皮爾森相關(guān)系數(shù)會(huì)隨著溫度點(diǎn)減少迅速惡化，而曼哈頓距離在較少溫度點(diǎn)上有最佳的預(yù)測(cè)能力。最終，作者確定了最適合的3個(gè)溫度點(diǎn)組合（37℃、49℃、58℃）和4個(gè)溫度點(diǎn)組合（37℃、46℃、55℃、61℃），并且已知數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩者高度相關(guān)。

圖1 Slim-TPCA溫度點(diǎn)的優(yōu)化

二、算法優(yōu)化，提高統(tǒng)計(jì)功效

TPCA通過(guò)和10000個(gè)隨機(jī)生成相同大小的基準(zhǔn)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的p值比較來(lái)識(shí)別各種條件下的關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物。與傳統(tǒng)TPCA方法中的絕對(duì)距離算法相比，作者優(yōu)化后的相對(duì)距離算法對(duì)計(jì)算CORUM配合物的TPCA特征與絕對(duì)距離算法計(jì)算的結(jié)果在10個(gè)溫度點(diǎn)和4個(gè)溫度點(diǎn)都保持較高的相關(guān)性（r=0.93/0.92）。并且，相對(duì)距離算法還確定了更高百分比的與細(xì)胞周期、DNA加工相關(guān)的蛋白質(zhì)復(fù)合物，例如參與DNA復(fù)制的RFC復(fù)合物被相對(duì)距離算法識(shí)別而被絕對(duì)距離算法遺漏。此外，傳統(tǒng)10000個(gè)隨機(jī)生成的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)獲得離散的p值，占用大量計(jì)算時(shí)間，作者使用基于擬合Beta分布的p值算法優(yōu)化了TPCA工作流程，以較小的樣本量擬合特定的數(shù)據(jù)分布估計(jì)p值，觀察到了更多動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)復(fù)合物，同時(shí)新算法采樣處理的時(shí)間只需要原始采樣處理時(shí)間的1%。

圖2 相對(duì)距離算法和擬合Beta分析的p值算法優(yōu)化

三、Slim-TPCA識(shí)別響應(yīng)葡萄糖

剝奪的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)復(fù)合物

為了驗(yàn)證改進(jìn)后的Slim-TPCA的適用性，作者將其用于研究CORUM注釋的蛋白質(zhì)復(fù)合物在葡萄糖剝奪下的動(dòng)力學(xué)。針對(duì)5個(gè)葡萄糖剝奪時(shí)間點(diǎn)，分析K562細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)復(fù)合物在三個(gè)溫度點(diǎn)的變化情況，共三組生物學(xué)重復(fù)，每組重復(fù)用一套16表TMT試劑標(biāo)記。結(jié)果表明，參與生物學(xué)過(guò)程的蛋白質(zhì)復(fù)合物被注釋為葡萄糖饑餓相關(guān)，并且細(xì)胞質(zhì)和線粒體核糖體的解離增加也與葡萄糖饑餓期間蛋白質(zhì)翻譯的衰減一致。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)許多參與呼吸或呼吸相關(guān)的線粒體蛋白復(fù)合物以及涉及囊泡的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物被調(diào)節(jié)，表明TPCA還適用于位于膜結(jié)合細(xì)胞器內(nèi)以及膜相關(guān)的蛋白質(zhì)復(fù)合物分析。

圖3 Slim-TPCA識(shí)別響應(yīng)葡萄糖剝奪的蛋白質(zhì)復(fù)合物

四、總結(jié)

綜上所述，作者對(duì)原始的TPCA方法進(jìn)行了升級(jí)，提出了新的Slim-TPCA，通過(guò)使用更少的溫度點(diǎn)和改進(jìn)的數(shù)據(jù)反卷積算法，將通量提高了三倍以上，統(tǒng)計(jì)計(jì)算時(shí)間減少了100倍，并且有更高靈敏度識(shí)別蛋白質(zhì)復(fù)合物，允許在細(xì)胞條件下大規(guī)模表征蛋白質(zhì)復(fù)合物，相關(guān)的數(shù)據(jù)分析算法作者也整理并發(fā)布了相關(guān)的Python包供相關(guān)研究者使用。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-43526-2

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