近日，南方科技大學(xué)田瑞軍教授課題組在bioRxiv上線了題為：“Multimodal single cell-resolved spatial proteomics reveals pancreatic tumor heterogeneity”的創(chuàng)新性研究。該研究展示了多模態(tài)的空間細(xì)胞類型蛋白組學(xué)技術(shù)Spatial and Cell-type Proteomics（SCPro），在單細(xì)胞分辨率下揭示了胰腺癌病理切片組織的異質(zhì)性。
一、文章要點(diǎn)概括
本文開發(fā)了用于可視化空間蛋白組學(xué)的SCPro技術(shù)。SCPro技術(shù)包含多色熒光染色FFPE切片的全景組織定量分析，多抗體熒光激活細(xì)胞分選(Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS)， 以衍生于Simple and Integrated Spintip-Based Technology (SISPROT)技術(shù)的ion exchange-based protein aggregation capture (iPAC) 技術(shù)為紐帶, 結(jié)合空間解卷積算法對胰腺癌的腫瘤微環(huán)境進(jìn)行深度解析。
利用SCPro技術(shù)，在同一張4色mIHC 切片上，以全景組織定量分析結(jié)果作為導(dǎo)航，實(shí)現(xiàn)多達(dá)6種細(xì)胞類型的原位單細(xì)胞精準(zhǔn)分離，100個組織單細(xì)胞可鑒定出>5000種蛋白質(zhì)。對來自同一周齡老鼠的胰腺癌組織，在每種細(xì)胞類型細(xì)胞數(shù)量小于等于1000個的情況下，SCPro 技術(shù)建立了14種細(xì)胞類型的蛋白表達(dá)圖譜。通過膜蛋白分析策略和空間解卷積算法, SCPro技術(shù)準(zhǔn)確預(yù)測了腫瘤和淋巴結(jié)構(gòu)中9種免疫細(xì)胞亞型的比例, 發(fā)現(xiàn)了一種新的免疫抑制T細(xì)胞亞型, 隨后精準(zhǔn)預(yù)測并驗(yàn)證其在胰腺癌腫瘤細(xì)胞區(qū)域而非淋巴結(jié)構(gòu)區(qū)域的空間特異性。
二、本文創(chuàng)新點(diǎn)
首先，開發(fā)了基于固相萃取技術(shù)的iPAC。該技術(shù)衍生于SISPROT技術(shù)，它特別適合處理空間蛋白組學(xué)中常見的H-E染色切片，及多色熒光染色切片樣本。染色組織樣品經(jīng)iPAC技術(shù)處理后可得到的多肽具有極高的性噪比（文中稱為污染指數(shù)，contamination ratio，CR）至接近商品化Hela digest的程度。因此，使用iPAC方法處理類似數(shù)量的組織單細(xì)胞和培養(yǎng)的細(xì)胞樣品可以達(dá)到類似的鑒定效果，在DDA 模式60min有效梯度且分別獨(dú)立搜庫（關(guān)閉MBR）的條件下，針對12μm厚度，0.0004mm2，0.0025mm2，0.01mm2，0.04mm2的H-E染色鼠腦組織樣品 （分別相當(dāng)于2.4，15，60，240個組織單細(xì)胞，以每個單細(xì)胞體積為2000μm3進(jìn)行估算），可分別鑒定出超過800，2000，3200，4400種蛋白質(zhì)（平均值）。
其次，該研究引入了多色熒光染色全景大視野高質(zhì)量成像+組織流式導(dǎo)航與定量分析+組織單細(xì)胞零失敗率精準(zhǔn)分離的工作流。該工作流解決了激光微切割樣本成像質(zhì)量不佳， 導(dǎo)致無法進(jìn)行mIHC切片全景準(zhǔn)確定量分析與導(dǎo)航的問題，同時解決了組織單細(xì)胞分離受激光損傷大、收集失敗率高且不穩(wěn)定的技術(shù)痛點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)了同一張切片原位高純度細(xì)胞類型的深度空間蛋白組學(xué)分析。
最后，該研究引入了流式分選細(xì)胞的膜蛋白生信分析策略并提出了針對空間蛋白組學(xué)的解卷積策略。這一策略充分發(fā)揮了流式分選細(xì)胞方法表征稀有細(xì)胞亞型的優(yōu)勢，同時利用空間蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)為稀有細(xì)胞亞型提供了空間定位。本研究為利用流式分選細(xì)胞類型蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)與空間蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)功能性的稀有細(xì)胞亞型及其空間定位提供了新的研究范式。例如本文通過上述策略發(fā)現(xiàn)了新的免疫抑制性細(xì)胞亞型Klrg1+Treg， 并將其定位在PDAC區(qū)域。
三、文章技術(shù)詳解
SCPro空間可視化蛋白組學(xué)技術(shù)路線
3.1 空間蛋白質(zhì)組
作者在厘米級的胰腺癌組織切片中通過多重免疫熒光的方式標(biāo)記了EpCAM+細(xì)胞、CD45+細(xì)胞和αSMA+細(xì)胞，共確定了胰腺癌的顯微切割區(qū)域。染色結(jié)果顯示在腫瘤從腺泡細(xì)胞到胰腺上皮內(nèi)瘤樣（PanIN）最后到PDAC的過程中，不同細(xì)胞類型細(xì)胞的空間分布有明顯不同。其中技術(shù)重點(diǎn)為（1）厘米級大視野高質(zhì)量成像與基于組織流式圈門的ROI選??；（2）基于導(dǎo)航ROI的單細(xì)胞精度分離與零損失樣品收集及質(zhì)控。
全景組織流式空間細(xì)胞類型導(dǎo)航與單細(xì)胞精度組織分離
3.2 細(xì)胞類型蛋白質(zhì)組
為了在空間層面上獲得更細(xì)致的細(xì)胞類型分布，作者在小鼠模型中，通過流式細(xì)胞術(shù)分離了14種細(xì)胞類型，包括4種CAFs，9種免疫細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞，每種細(xì)胞類型分選1000個細(xì)胞，并進(jìn)行質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測，共鑒定了超過7000種蛋白質(zhì)。
基于細(xì)胞分選的細(xì)胞類型蛋白質(zhì)組
3.3 高靈敏樣品處理及數(shù)據(jù)采集
基于iPAC技術(shù)的高靈敏度蛋白組學(xué)處理，色譜分離及質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集是支持空間蛋白質(zhì)組和細(xì)胞類型蛋白質(zhì)組獲得深度蛋白質(zhì)定性定量分析的根本。本研究帶給我們的重要啟示是，多肽的信噪比或“干凈”程度與多肽的回收率同等重要，如下圖所示，使用基于固相萃取的iPAC技術(shù)， 通過染色組織獲得多肽的干凈程度接近于商品化的Hela digest，對0.04mm2*12μm（相當(dāng)于240個組織單細(xì)胞）H-E染色鼠腦切片，在質(zhì)譜總信號相當(dāng)?shù)那闆r下，鑒定量可提高3倍以上。在DDA且關(guān)閉MBR的模式下可鑒定出超過4400種蛋白質(zhì)。
iPAC技術(shù)原理與效果
四、應(yīng)用解讀
4.1 SCPro技術(shù)揭示不同進(jìn)展階段胰腺癌細(xì)胞的空間蛋白質(zhì)組特征
基于高質(zhì)量的全景組織流式定量分析，該研究展示了胰腺癌發(fā)展不同階段，即從正常腺泡（Acinar）到腺上皮內(nèi)瘤變 (PanIN) 以及最終的胰腺導(dǎo)管癌 (PDAC)周圍不同距離的免疫細(xì)胞， 間質(zhì)的空間定量分布特征。
從60-100個FFPE組織單細(xì)胞中， SCPro技術(shù)可鑒定出3000-5000種蛋白質(zhì)（通常來說3000個及以上的蛋白深度是發(fā)現(xiàn)功能性蛋白的門檻）， 主成分分析（PCA）可以很好的區(qū)分不同發(fā)展階段的胰腺癌腫瘤細(xì)胞。同時，已報道的生物標(biāo)志物蛋白也在Acinar， PanIN以及PDAC階段的胰腺癌細(xì)胞中顯著富集。其次，各階段的Top功能性通路與文獻(xiàn)中已報道的相關(guān)通路相吻合。最后，SCPro技術(shù)找到了在腫瘤進(jìn)展過程中， 特別是在PanIN階段發(fā)生顯著變化的功能性蛋白，這為發(fā)現(xiàn)潛在的胰腺癌早篩生物標(biāo)志物提供了重要的參考。
胰腺癌腫瘤進(jìn)展過程中蛋白組學(xué)變化特征
4.2 SCPro技術(shù)揭示胰腺癌細(xì)胞周圍及附近淋巴結(jié)構(gòu)中免疫細(xì)胞的空間蛋白質(zhì)組特征
作者在厘米級的胰腺癌組織切片中通過多重免疫熒光的方式標(biāo)記了EpCAM+細(xì)胞、CD45+細(xì)胞和αSMA+細(xì)胞，確定了胰腺癌的顯微切割區(qū)域。染色結(jié)果顯示在腫瘤從腺泡細(xì)胞到胰腺上皮內(nèi)瘤樣（PanIN）最后到PDAC的過程中，不同細(xì)胞類型細(xì)胞的空間分布有明顯不同。SCPro技術(shù)揭示了PDAC區(qū)域的免疫細(xì)胞與淋巴結(jié)構(gòu)中的免疫細(xì)胞具有顯著不同的蛋白組學(xué)特征。
4.3 SCPro技術(shù)揭示PDAC及鄰近淋巴結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞亞群分布比例
使用特色的細(xì)胞膜marker篩選策略，利用Phobius和DeepTMHMM預(yù)測跨膜蛋白，結(jié)合Tangram解卷積算法，發(fā)現(xiàn)了新的免疫抑制性Treg細(xì)胞亞型，為了在空間層面上獲得更細(xì)致的細(xì)胞類型分布，作者在小鼠模型中，通過流式細(xì)胞術(shù)分離了14種細(xì)胞類型，包括4種CAFs，9種免疫細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞，每種細(xì)胞類型分選1000個細(xì)胞，并進(jìn)行質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測，共鑒定了超過7000種蛋白質(zhì)。然后，作者通過Tangram解卷積空間解卷積算法進(jìn)一步解碼腫瘤PDAC（IT）區(qū)域和PDAC臨近淋巴結(jié)構(gòu)（LN）區(qū)域中11種細(xì)胞亞群的占比，并通過多重免疫熒光染色Krt19（腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物）、CD11b（髓系細(xì)胞標(biāo)志物）、CD3（淋巴細(xì)胞標(biāo)志物）進(jìn)行驗(yàn)證?？臻g解卷積算法預(yù)測的IT區(qū)域的髓系細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的比例為77.53% 與 22.47%， 這與實(shí)際多色熒光染色（ground truth）的細(xì)胞比例高度一致， 分別為73% 和27%， 這證明了空間解卷積算法的準(zhǔn)確性。
空間解卷積算法預(yù)測11種免疫細(xì)胞亞群比例
4.4 SCPro技術(shù)發(fā)現(xiàn)新的免疫抑制性細(xì)胞亞型并預(yù)測其定位于PDAC區(qū)域
使用特色的細(xì)胞膜marker篩選策略，利用Phobius 和 DeepTMHMM預(yù)測跨膜蛋白，發(fā)現(xiàn)了新的免疫抑制性Treg細(xì)胞亞型。進(jìn)一步的空間解卷積算法將其定位于PDAC區(qū)域而非臨近的淋巴結(jié)構(gòu)區(qū)域。
SCPro技術(shù)發(fā)現(xiàn)Klrg1+Treg亞群及其空間定位
五、總結(jié)
綜上所述，作者開發(fā)了名為SCPro的空間可視化蛋白組學(xué)技術(shù)，并且通過將流式分選得到的細(xì)胞類型蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)反卷積到空間蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞亞型并預(yù)測新細(xì)胞亞型的空間位置。這一方案擴(kuò)展了傳統(tǒng)數(shù)字組織病理學(xué)的全面性，為精細(xì)化研究組織微環(huán)境異質(zhì)性和細(xì)胞亞群的空間分布提供了全新的分析方案參考。
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